cDNA (complementary DNA) 합성 Protocol

cDNA (Complementary DNA)이란?

 

 

세포 내에 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 먼저 합성하고 합성된 cDNA를 다시 주형으로 하여 

 

유전자의 발현 정도를 측정한다.

 

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cDNA 합성 원리

 

Reverse transcription-PCR은 세포에서 추출된 Total RNA (rRNA, tRNA, mRNA 등)에서 

 

mRNA에서만 존재하는 Poly A tail을 detect하는 Oligo dT를 primer로 사용하여 

 

reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성한다.

 

 

cDNA 합성 과정

 

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cDNA 합성 목적

 

각 세포 (Cell)이나 조직 (Tissue)에서 발현되는 mRNA를 분리 정제하여 역전사효소를 사용하여 

 

 

합성된 cDNA를 기반으로 세포내에 유전자의 발현 정도를 확인하고자 한다.

 

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cDNA 합성 방법

 

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Cat No. 4368814) 제품을 사용하여 추출된 mRNA를 

 

 

기본으로 한 cDNA를 합성하고자 함.

 

 

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cDNA 합성 Protocol

1. 추출된 mRNA를 나노드랍을 이용하여 mRNA 농도를 확인한다.
→ 확인된 mRNA 농도의 단위는 ng/ul이다

 

2. mRNA 정량을 수행한다.

예를 들어 측정된 mRNA의 150ng/ul (total volume: 20μl)이고, 합성 최종농도가 1ug/ul일 경우,
아래와 같이 정량을 수행한다.

 

mRNA 정량 및 합성

 

3. 위 표에서 제시된 정량값을 샘플 하나당 PCR tube에 섞어준다.

 

4. cDNA 합성조건은 25 ℃ : 10min / 37 ℃ : 120min / 85 ℃ : 5min / 4 ℃ : ∞ 로 설정한다.

 

5. 합성 후 단기보관 시 4 ℃, 장기보관 시 -20 ℃에서 관리한다.